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    ELISA實驗中常遇到的問題、產生的原因與解決辦法

    發布時間: 2021-09-10  點擊次數: 6096次

    酶聯免疫吸附實驗,簡稱為 ELISA。ELISA 實驗是一種非常經典的免疫學實驗。雖然歷史非常悠久了,但是還是不斷地在臨床和基礎研究中得到應用。其主要用于:免疫酶染色各種細胞內成份的定位;研究抗酶抗體的合成;顯現微量的免疫沉淀反應;定量檢測體液中抗原或者抗體成份。小編總結了一些經驗教訓。遇到的問題,可能的原因,解決方法。供大家參考。


    問題 1:陽性與陰性不能達到 2.1 的比值,陰性顏色太深。

    可能的原因:陰性對照(也就是陽性對照的除目標抗原外的其它成分)中有某種成分與一抗作用。

    解決的方法:純化抗原除去干擾成分。


    問題 2:陽性與陰性不能達到 2.1 的比值,陽性顏色太淺。

    可能的原因有 3 個: 1)一抗效價不好。 2)抗原太稀。 3)封閉時間過長。

    解決的方法: 1)換用一抗或增加一抗用量。 2)增加抗原濃度。 3)縮短封閉時間,封閉時間一般 37 攝氏度 3 個小時,或者 4 攝氏度過夜。不能比這個更長了。


    問題 3:增加抗原濃度,一抗濃度不變,顯色反應沒有表現出應有的梯度。

    可能的問題: 一抗與抗原的比例已經飽和。

    解決的方法: 增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。


    問題 4:增加一抗濃度,顯色反應沒有表現出應有的梯度。

    可能的原因:一抗與抗原的比例已經飽和。

    解決的方法:增加抗原用量;或在抗原用量不變的情況下減少一抗濃度做梯度。


    問題 5:加完 TMB 顯色后顏色梯度很明顯,但加了硫酸終止反應后顏色梯度沒有那么明顯了。

    可能的原因:硫酸可能把其它成分都炭化了。

    解決的辦法:加少一點硫酸,參考值:50 μlTMB+35 μl 硫酸;或者采用 1M 的 HCL 作為終止液,50ulTMB+50ul1M HCL。


    這些步驟里面,一抗和封閉是兩個關鍵。如果 ELISA 做不出滿意的結果,首先應該從這兩個方面改進。Elisa 實驗看似簡單,其實不然。別小瞧了ELISA。光是一個加樣就有很多講究。


    ELISA 中加樣須注意如下問題:

    吸取樣品時,加樣槍吸頭不應黏附多余的液體;加樣時不可 90 度向孔中滴加液體,這樣會導致液體殘留在吸頭上,加樣不準確! 不要將吸頭伸入孔中,一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭,另一方面可能會將孔中的液體吹起來,加樣不準確! 正確的加樣方法應為 45 度,吸頭貼著孔壁加入,應注意: 角度太小,會使液體殘留在孔壁上,導致加樣不準確! 吸頭應當貼著管壁和液面的交界處!


    ELISA實驗中常遇到的問題、產生的原因與解決辦法


    綜上所述,Elisa 實驗看似簡單,其實還是有很多細節需要我們注意的。以上介紹了 Elisa 實驗的一些經驗教訓,希望對大家有所幫助。


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