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非肌肉肌動蛋白的純化
發布時間： 2022-12-06 點擊次數： 1376次材料與儀器
非肌肉肌動蛋白
DNA 酶Ⅰ緩沖液
DEAE 柱步驟
1. 準備貯存液和材料。
2x DNA 酶Ⅰ緩沖液：
20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0
1 mmol/L DTT
0.4 mmol/L CaCI2
0.4 mmol/L ATP
抑蛋白酶肽
抑蛋白酶
亮抑蛋白酶肽
抑胃酶肽 A
PMSF
TPCK
50% 甲醛在 DNA 酶柱緩沖液中
0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中
0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中
DNA酶Ⅰ柱緩沖液
2. 準備一個 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的親和柱。
3. 準備一個 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ緩沖液平衡的 DEAE-纖維素。
4. 通過離心收集細胞并用等滲鹽溶液（例如 PBS ) 洗去培養液。
5. 在加蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液中重懸細胞沉淀物。
6. 用對于感興趣細胞的標準方法進行細胞勻漿。
7. 用相差顯微鏡證實超過 99% 的細胞已經裂解了。
8. 100000 g 離心裂解物 45 分鐘。
9. 用巴斯德吸管轉移上清，避免混入脂肪。
10. 柱子上樣：
(1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ緩沖液加蛋白酶抑制劑平衡了的 DNA 酶Ⅰ親和介質混合，并把介質/蛋白混合物倒到一個小桿子中。
(2) 在裝填柱子時收集流出液，通過用抗肌動蛋白抗體進行的免疫印跡、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 來證實有大量肌動蛋白留在柱子中。
11. 用 2 倍體積含蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制劑和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子。
12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫肌動蛋白。
13. 立即把 50% 甲醛洗脫液上樣到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。
14. 用 5 倍體積的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫。分部收集，每管 200 μl。
15. 檢測收集液的蛋白濃度，然后混合出峰時的收集液。
16. 加 MgCl2 使濃度為 2 mmol/L ( 這是選用于天然肌動蛋白），以使肌動蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽組成。
產量應該是 5% 左右，所以從濕重 10 g 的細胞指望得到 2.5~5 mg 純化了的肌動蛋白是合理的。以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。
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