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大腸桿菌質粒DNA的提取
發布時間： 2023-04-19 點擊次數： 1606次實驗方法原理 堿法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異來分離它們。在堿性pH環境，DNA變性，當恢復中性并在高鹽離子濃度時，絕大多數質粒DNA可以準確復性，留在上清中；而線性染色體DNA不能準確復性，相互交聯纏繞附著在細胞壁碎片上與蛋白質發生沉淀。離心后獲得大量質粒的上清液，利用親水性有機溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質粒DNA脫水，離心后收集。 實驗材料 含質粒的大腸桿菌試劑、試劑盒 葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 異戊醇儀器、耗材 臺式高速離心機 恒溫振蕩搖床 高壓滅菌鍋 振蕩器 微量移液器 1.5ml離心管實驗步驟 一、試劑配制
1. LB液體培養基。
2. 100 mg/ml氨芐西林儲存液：稱取25g的氨芐西林粉末，加去離子水至250ml，全部溶解后過濾、分裝，20℃保存。
3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去離子水至500ml，高壓滅菌，貯存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧化鈉溶液，1％ SDS（10 N 氫氧化鈉20 μl，10％SDS 100μl，加去離子水至1ml），使用前臨時配制。
5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml，冰醋酸57.5ml，加去離子水至500ml，4℃保存。
6. 苯酚：氯仿（1：1，V／V）（酚和氯仿均有很強的腐蝕性操作時應戴手套！）。
7. 無水乙醇。
8. 70％乙醇。
9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解，然后在沸水煮
15min，分裝，20℃保存。
10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。
二、實驗方法
1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養
基中。37℃、250 r/min振蕩培養過夜（約12——14h）。
2. 取1.5ml細菌培養液倒入離心管中，4℃、6000轉離心30s，棄上清，將離心管倒置于紙巾上，去除殘留液體。
3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，室溫下放置5 min。
4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5——10次，以混勻內容
物，冰浴5min。
5. 加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和顛倒5——10次混勻，冰浴3——5min，4℃、6000轉離心5min。轉移上清到一個新的1.5ml Ep管中。
6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑，振蕩混勻，4℃、6000轉，離心2 rain。
7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍體積用冰預冷的無水乙醇于室溫沉淀雙鏈
DNA，混勻，室溫放置2--5rain，4℃、6000轉離心5min。
8. 棄上清，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數次，4℃、6000轉，離心2min。
9. 去除所有的乙醇溶液，將管倒置于紙巾上使液體流盡，室溫干燥5——10min，直到乙醇都揮發干凈。
10.將質粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中，溫和振蕩數秒，-20℃儲存備用。
注意事項 1. 溶液Ⅰ與溶菌液充分搖勻，用力適當。因為此時細菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必擔心其分子斷裂，一般可用力振蕩幾次。 2. 加入SDS后則要注意不能過分用力振蕩，溫和混勻，但又必須讓它反應充分。
3. 加入溶液Ⅱ混勻之后，一定要在冰上放置，不要搖動，對于溶液Ⅲ同樣處理。
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